采用(yòng)實(shí)时(shí)熒光(guāng)PCR技术，針(zhēn)对(duì)阪崎腸(cháng)杆菌特(tè)异(yì)性(xìng)基因(yīn)設計(jì)引物(wù)和(hé)探針(zhēn)。PCR擴增过(guò)程中(zhōng)，與(yǔ)模闆結合的(de)探針(zhēn)被(bèi)Taq酶分(fēn)解(jiě)产生(shēng)熒光(guāng)信(xìn)号(hào)，熒光(guāng)定(dìng)量(liàng)PCR儀根(gēn)據(jù)檢測到(dào)的(de)熒光(guāng)信(xìn)号(hào)繪制出(chū)實(shí)时(shí)擴增曲(qū)線(xiàn)，從而(ér)實(shí)現(xiàn)阪崎腸(cháng)杆菌在(zài)核酸(suān)水(shuǐ)平上(shàng)的(de)定(dìng)性(xìng)檢測。

1、样品处理(lǐ)

1）按照GB 4789.40-2016，取(qǔ)样品100g（mL），加入(rù)到(dào)含有900mL預热(rè)到(dào)44℃ BPW的(de)無菌容器中(zhōng)均質(zhì)，調节pH至(zhì)6.8±0.2。

2）36±1℃培養18-24h。

注：也(yě)可(kě)參考其(qí)他(tā)地(dì)方(fāng)标(biāo)準進(jìn)行样品的(de)前(qián)处理(lǐ)。

2、核酸(suān)提(tí)取(qǔ)        

1）取(qǔ)40μL增菌液于(yú)裂解(jiě)液管(guǎn)中(zhōng)，98℃或(huò)沸水(shuǐ)浴10min。

2）冷(lěng)卻至(zhì)室(shì)温(wēn)，吸取(qǔ)上(shàng)清(qīng)備用(yòng)或(huò)者(zhě)置于(yú)-20℃保存。

3、反(fǎn)應(yìng)體(tǐ)系(xì)配置

從试劑盒中(zhōng)取(qǔ)出(chū)ES預混液，充分(fēn)融化(huà)，短暫离心(xīn)，然後(hòu)将陰性(xìng)对(duì)照、样品的(de)DNA提(tí)取(qǔ)液、陽性(xìng)对(duì)照各(gè)取(qǔ)5μL分(fēn)别加入(rù)PCR管(guǎn)中(zhōng)，蓋好(hǎo)管(guǎn)蓋，短暫离心(xīn)，立即進(jìn)行PCR擴增反(fǎn)應(yìng)。

4、PCR擴增       

PCR管(guǎn)或(huò)PCR闆置于(yú)PCR儀上(shàng)，推薦反(fǎn)應(yìng)程序設定(dìng)如下(xià)：反(fǎn)應(yìng)體(tǐ)系(xì)为(wèi)25μL，在(zài)第(dì)二(èr)步每个(gè)循环(huán)60℃时(shí)檢測熒光(guāng)信(xìn)号(hào)，檢測通(tòng)道(dào)選擇FAM。 

注：使用(yòng)ABI系(xì)列PCR儀器，如果(guǒ)不(bù)添加ROX，“passive reference”和(hé) “quencher”均選擇“none”。